تهیه یک لام بافت شناسی فقط یک «روال فنی» نیست. هر مرحله از این مسیر اگر درست فهم و اجرا نشود، میتواند تصویر نهایی زیر میکروسکوپ را مخدوش کند و در نهایت تشخیص پاتولوژیک را تحتتأثیر قرار دهد. با همین منطق ما در این مقاله سایتن پاتولوژی شاپ کوشیدیم نگاهی مبتنی برگام های مشخص را ارائه کنیم تا بتواند به عنوان یک الگوی واضح مراحل مختلف را به شما یادآوری کند و البته اهمیت هر مرحله را نیز به اختصار بیان کردیم.
مراحل تهیه لام بافت شناسی
کار تهیه یک لام بافت شناسی از کجا شروع میشود؟ بله از نمونهبرداری و پذیرش در آزمایشگاه، لام بافت شناسی ادامه مستقیم نمونه بالینی است؛ یعنی: یک جراح، متخصص گوارش، متخصص پوست یا هر پزشک دیگری، تکهای از بافت را برمیدارد؛ این نمونه همراه با درخواستنامه و مشخصات بیمار به آزمایشگاه میرسد. برای فهم ادامه کار، باید یک سوال ساده را همیشه در ذهن داشته باشیم: «از لحظه جدا شدن بافت از بدن، چطور ساختار سلولی را در نزدیکترین حالت به وضعیت زنده حفظ کنم تا زیر میکروسکوپ معنیدار بماند؟» مهمترین این مراحل از لحاظ علمی و عملی عبارتند از:
فیکساسیون (fixation)؛ توقف زمان برای بافت
هدف فیکساسیون متوقف کردن فعالیتهای آنزیمی و تجزیه بافت و جلوگیری از رشد میکروارگانیسمها است. در عین حال پروتئینها و ساختارهای سلولی تثبیت میشوند و مورفولوژی بافت برای برش و رنگآمیزی حفظ میگردد.
پردازش بافت (tissue processing)؛ آمادهسازی برای ورود به پارافین
بعد از فیکساسیون، بافت هنوز پر از آب است. ولی در مرحله بعد میخواهیم آن را داخل یک ماده جامد مثل پارافین قرار دهیم تا قابل برش با میکروتوم شود. آب و پارافین با هم مخلوط نمیشوند؛ پس باید طی چند گام، آب را حذف و آن را با ماده مناسب جایگزین کنیم. مراحل مهم پردازش بافت:
- آبگیری (dehydration)
- شفافسازی (clearing)
- نفوذ و تزریق پارافین (infiltration)
- قالبگیری در پارافین (embedding)؛ تبدیل بافت به یک بلوک قابل برش
نکات مفهومی مهم:
جهتگیری بافت: اینجا همان جایی است که «آناتومی» اهمیت عملی پیدا میکند. مثلاً اگر یک قطعه پوست را طوری قرار دهیم که اپیدرم در سطح برش قرار نگیرد، در برشهای نهایی معماری اپیدرم و درم بهدرستی دیده نمیشود.
عدم ایجاد حباب: حباب هوا در بلوک، زیر میکروسکوپ به شکل حفره و آرتیفکت ظاهر میشود.
سرد شدن یکنواخت:
بلوک باید بهصورت کنترل شده سرد شود؛ سرد شدن بسیار سریع میتواند باعث ایجاد ترک در بلوک شود.
برش با میکروتوم (microtomy)؛ ساختن مقطع نازک برای لام
یکی از حساسترین مراحل از نظر فنی میکروتومی یا برشزدن بلوک پارافین به ورقههای بسیار نازک است. ورقههای نازک پارافینی بعد از برش، معمولاً بهصورت یک «نوار روبانی» (ribbon) از لبه بلوک جدا میشوند. سپس با کمک یک لام شیشهای و آب گرم، این برشها روی سطح لام منتقل میشوند.
چسباندن برش روی لام شیشهای و خشککردن
لام شیشهای که قرار است تا پایان مسیر، حامل مقطع بافتی باشد؛ باید تمیز و بدون چربی باشد. در بسیاری از آزمایشگاهها، سطح لام با موادی مثل آلبومین یا چسبهای مخصوص پوشانده میشود تا چسبندگی برش به شیشه بهتر باشد. این بخش شامل این مراحل است:
- نوار برشها روی سطح آب گرم (حمام شناور) قرار میگیرد تا چینوچروکها باز شود.
- لام شیشهای زیر نوار میرود و مقطع روی سطح لام مینشیند.
- لامها برای مدتی در آون (oven) یا روی صفحه گرم قرار میگیرند تا پارافین کمی ذوب شود و برش به شیشه بچسبد.
رنگآمیزی (staining)؛ تبدیل تصویر خاکستری به نقشه خوانا
مقاطع پارافینی بیرنگاند. برای دیدن ساختارهای سلولی و بافتی، باید از رنگآمیزی استفاده کنیم. برای تهیه لام بافت شناسی با تصویری ثابل روئیت و بررسی باید گامهای زیر به دقت برداشته شوند:
- دپارافینه کردن و بازگرداندن بافت به محیط آبی
- رنگآمیزی روتین هماتوکسیلین – ائوزین (H&E)
- دهیدراتاسیون مجدد و شفافسازی
- لاملگذاری، برچسبگذاری و نگهداری
سؤالات متداول درباره مراحل تهیه لام بافت شناسی
۱. چرا فیکساسیون (fixation) اینقدر اهمیت دارد؟
فیکساسیون مرحلهای است که تعیین میکند ساختار سلولها و بافتها چقدر شبیه وضعیت واقعی بدن باقی بماند. اگر فیکساسیون درست انجام نشود ممکن است آنزیمها بافت را هضم کنند، باکتریها باعث تخریب و تعفن شوند و نهایتاً زیر میکروسکوپ بهجای الگوی منظم بافت، تودهای نامنظم و غیرقابل تفسیر دیده میشود.
۲. چرا نمونههای بزرگ باید قبل از فیکساسیون برش بخورند؟
فیکساتور از سطح به عمق بافت نفوذ میکند. اگر نمونه یک توده ضخیم باشد، سطح بیرونی سریعتر فیکس میشود اما مرکز توده ممکن است ساعتها یا روزها بدون فیکساسیون بماند و نتیجه مرکز توده نکروتیک و تخریبشده شود.
۳. چرا در بافت شناسی روتین از رنگآمیزی هماتوکسیلین – ائوزین (H&E) استفاده میشود؟
H&E یک تعادل ساده اما بسیار مؤثر فراهم میکند: هماتوکسیلین هسته را آبی/بنفش میکند؛ محل ذخیره DNA و الگوی تقسیم سلولی را واضح نشان میدهد. ائوزین سیتوپلاسم و بسیاری از ساختارهای زمینهای را صورتی/قرمز میکند. برای همین، H&E بهعنوان زبان مشترک پاتولوژیستها در سراسر دنیا پذیرفته شده است.
۴. تفاوت بافت شناسی و سیتولوژی در تهیه لام چیست؟
در بافتشناسی، ما با تکه بافت سهبعدی سروکار داریم و سعی میکنیم معماری بافتی را حفظ کنیم؛ در نتیجه: فیکساسیون، پردازش پارافینی، قالبگیری و برش با میکروتوم مراحل اصلیاند. اما در سیتولوژی تمرکز بر سلولهای مجزا است (مثلاً اسمیر دهانه رحم، مایع افیوژن) و در بسیاری موارد، مراحل پارافینی طی نمیشود و نمونه بهصورت اسمیر مستقیم، سیتوسپین یا بلوک سلولی آماده میشود. منطق مشترک هر دو، حفظ مورفولوژی سلول و هسته است اما جزییات تکنیکی متفاوتاند.
یک پیشنهاد: برای آشنایی بیشتر با انواع لام پاتولوژی میتوانید به آدرس https://www.virtualpathology.leeds.ac.uk/slides مراجعه کنید. در کتابخانه مجازی اسلایدهای پاتولوژی مجموعهای از اسلایدهایی است که توسط یک پاتولوژیست آموزشدیده دیجیتالی و گردآوری شدهاند. این اسلایدها به همراه اطلاعات بالینی ناشناس خود ذخیره میشوند که میتوانند برای آموزش و تمرین مورد استفاده قرار گیرند.
سخن پایانی
تهیه یک لام پاتولوژی مناسب برای بررسی زیر میکروسکوپ یک هدف نیست بلکه تهیه کردن یک ابزار مناسب برای پاتولوژیست است تا بتواند حداکثر کمک ممکن را به تشخیص و طراحی مراحل درمان انجام دهد بنابراین مسئولیت پذیری، دقت، مهارت و استفاده بهینه از تجهیزات و مواد مورد نیاز در مراحل تهیه لام بافت شناسی در آزمایشپاه پاتولوژی از اهمیت بالایی برخوردار است. آنچه در این مقاله سایت پاتولوژی شاپ ارائه شد بیشتر یک بازخوانی کلی از مقالاتی بود که تا کنون در مورد بخشهای مختلف و مفاهیم ذکر شده در این مقاله در همین سایت ارائه کردیم. برای دست یابی به جزئیات بیشتر میتوانید به بخش مقالات سایت پاتولوژی شاپ به آدرس https://pathologyshop.com·مراجعه فرمائید.
منابع
https://www.hopkinsmedicine.org/news/articles/2024/04/a-pathology-revolution-one-slide-at-a-time