رنگ‌آمیزی گرم

توسعه تکنولوژی و پیشرفت علمی انسان، هر روز تکنیک‌های جدیدی را برای فهم بهتر فیزیولوژی و پاتولوژی در آزمایشگاه‌های تخصصی معرفی می‌کند. یکی از این تکنیک‌های کاربردی رنگ آمیزی گِرَم یا گِرَم مثبت است. در این مقاله سایت BIO-OPTICA به معرفی مختصر این تکنیک تشخیصی آزمایشگاهی می‌پردازیم. با ما همراه باشید.

رنگ‌آمیزی گِرَم، چیستی و کاربردها

رنگ‌آمیزی گِرَم (Gram Staining) یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین تکنیک‌های رنگ‌آمیزی در میکروبیولوژی است که برای شناسایی و تفکیک انواع باکتری‌ها به دو دسته اصلی گِرَم مثبت و گِرَم منفی استفاده می‌شود. این روش به عنوان یکی از پایه‌ای‌ترین تکنیک‌ها برای طبقه‌بندی باکتری‌ها در پزشکی و میکروبیولوژی شناخته می‌شود.

چیستی رنگ‌آمیزی گِرَم

رنگ‌آمیزی گِرَم یک تکنیک چندمرحله‌ای است که در آن از ترکیبی از رنگ‌ها (که معمولاً به آن‌ها رنگ‌های کریستال ویوله و ید گفته می‌شود) برای شناسایی ویژگی‌های خاص دیواره سلولی باکتری‌ها استفاده می‌شود. این رنگ‌آمیزی مدلی برای تفکیک باکتری‌ها بر اساس ساختار دیواره سلولی آن‌ها است. در این روش، باکتری‌ها به دو دسته کلی تقسیم می‌شوند:

• باکتری‌هایی که دیواره سلولی ضخیم‌تری دارند یا گِرَم مثبت
• باکتری‌هایی که دیواره سلولی نازک‌تر و غشای خارجی اضافی دارند یا گِرَم منفی

مراحل رنگ‌آمیزی گِرَم باعث می‌شود که باکتری‌ها رنگ متفاوتی از یکدیگر بگیرند و این امر در شناسایی و درمان عفونت‌ها اهمیت زیادی دارد.

 ◁◁ مطالب مرتبط: پاتولوژی چگونه انجام می‌شود 

مراحل رنگ‌آمیزی گِرَم

رنگ‌آمیزی گِرَم از چهار مرحله اصلی تشکیل شده است که به ترتیب عبارتند از:

• رنگ‌آمیزی اولیه با کریستال ویوله (Crystal Violet)

ابتدا لام حاوی نمونه میکروبی با استفاده از رنگ کریستال ویوله رنگ‌آمیزی می‌شود. این رنگ یک رنگ بنفش است که به تمام سلول‌های باکتری وصل می‌شود.

• مرحله بعدی ید زدن (Iodine)

در این مرحله، محلولید (یودین) به لام اضافه می‌شود. ید به عنوان ماده تثبیت‌کننده عمل کرده و کریستال ویوله را در داخل سلول باکتری‌ها تثبیت می‌کند بنابراین رنگ از دست نمی‌رود.

• شستشو با الکل یا استون (Decolorization)

این مرحله یکی از مهم‌ترین مراحل رنگ‌آمیزی گِرَم است. در این مرحله، باکتری‌ها با استفاده از الکل یا استون شستشو داده می‌شوند. این شستشو باعث می‌شود که سلول‌های باکتریایی گِرَم مثبت رنگ کریستال ویوله را حفظ کنند اما در باکتری‌های گِرَم منفی، رنگ از بین می‌رود زیرا دیواره سلولی نازک‌تر است و نمی‌تواند رنگ را نگه دارد.

• رنگ‌آمیزی ثانویه با سافرانین (Safranin)

در این مرحله، رنگ سافرانین که یک رنگ قرمز است، به لام اضافه می‌شود. باکتری‌های گِرَم منفی که در مرحله قبل رنگ خود را از دست داده‌اند، اکنون رنگ سافرانین را جذب می‌کنند و به رنگ قرمز درمی‌آیند، در حالی که باکتری‌های گِرَم مثبت همچنان رنگ بنفش خود را حفظ می‌کنند.

کاربردهای رنگ‌آمیزی گِرَم

رنگ آمیزی گِرَم کاربردهای مختلفی دارد که به برخی از آن‌هامختصراً اشاره می‌شود.

• تشخیص سریع نوع باکتری‌ها

یکی از مهم‌ترین کاربردهای رنگ‌آمیزی گِرَم، شناسایی اولیه نوع باکتری است. با استفاده از این روش می‌توان به سرعت باکتری‌های گِرَم مثبت و گِرَم منفی را از هم تمییز داد و اطلاعات اولیه در مورد نوع عفونت به دست آورد. این اطلاعات برای تصمیم‌گیری در مورد درمان‌های آنتی‌بیوتیکی حیاتی هستند.

• راهنمایی در انتخاب طرح درمان‌ آنتی‌بیوتیکی

بسیاری از آنتی‌بیوتیکیهایی که برای درمان عفونت‌های باکتریایی استفاده می‌شوند، بر اساس نوع باکتری (گِرَم مثبت یا گِرَم منفی) مؤثر هستند. به عنوان مثال، باکتری‌های گِرَم مثبت ممکن است نسبت به آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند پنی‌سیلین حساس‌تر باشند، در حالی که باکتری‌های گِرَم منفی ممکن است نیاز به آنتی بیوتیک های دیگر داشته باشند.

• تفکیک باکتری‌های بیماری‌زا

با استفاده از رنگ‌آمیزی گِرَم، می‌توان به تفکیک باکتری‌های بیماری‌زا مانند استافیلوکوکوس اورئوس (گِرَم مثبت) و اکریشیا کولی (گِرَم منفی) پرداخت.

• مطالعات اپیدمیولوژیک

مطالعات اپیدمیولوژیک برای شناسایی و کنترل شیوع عفونت‌ها انجام می‌شود. جمع آوری سریع اطلاعات در مورد نوع باکتری‌ها می‌تواند به تسریع کنترل بیماری‌ها کمک کند.

• تشخیص در مقاطع بافتی

در نمونه‌های بافتی، این روش می‌تواند برای شناسایی باکتری‌های موجود در بافت‌های آلوده به کار رود و در تشخیص دقیق‌تر عفونت‌های باکتریایی مفید باشد.

مراحلی که قبل از رنگ آمیزی گرم باید انجام شوند

پیش از انجام رنگ‌آمیزی گِرَم (Gram Staining) بر روی نمونه‌های میکروبی، چند مرحله ضروری وجود دارد که باید با دقت انجام شوند. این مراحل برای اطمینان از کیفیت و صحت نتایج رنگ‌آمیزی بسیار مهم هستند. در اینجا مراحل اصلی قبل از شروع رنگ‌آمیزی گِرَم را توضیح می‌دهیم:

• آماده‌سازی لام

انتخاب لام مناسب، تمیز و بدون هر گونه آلودگی. قبل از شروع هر فرآیندی، لام باید به خوبی تمیز و از وجود هر گونه آلودگی یا چربی عاری شود. برای تمیز کردن لام، می‌توان از الکل یا استون استفاده کرد. در صورتی که لام به هر دلیلی قبلاً مورد استفاده موقت قرار گرفته میتوان برای تمییز کردن آنرا اسیدواش کرد

• تهیه نمونه میکروبی

برای آماده‌سازی و تهیه اسمیر (Smear) نمونه‌های میکروبی از محیط کشت (مانند آگار یا مایع کشت) برداشته و روی لام شیشه‌ای پخش می‌شوند. این کار باید به گونه‌ای انجام شود که لایه‌ای یکنواخت و نازک از میکروب‌ها روی لام ایجاد شود. به این مرحله تهیه کشش یا Smear می‌گویند.

اضافه کردن مقداری آب به نمونه‌های خشک: اگر نمونه میکروبی از محیط خشک برداشته شود، به آن باید مقداری آب مقطر اضافه کرد تا رقیق شود و از ایجاد لایه ضخیم جلوگیری شود.

• خشک کردن نمونه

پس از پخش نمونه بر روی لام، باید اجازه داده شود که نمونه به‌طور طبیعی خشک شود یا می‌توان لام را زیر دستگاه هات‌بلوک (یا منبع حرارتی) قرار داد تا سریع‌تر خشک شود. دقت کنید که نمونه نباید بیش از حد گرم شود زیرا این امر می‌تواند به تخریب بافت میکروب‌ها منجر شود.

• ثبیت نمونه (Fixation)

ثبیت نمونه با حرارت: بعد از خشک شدن کشش، به منظور چسبیدن باکتری‌ها به لام و جلوگیری از شسته شدن آن‌هاهنگام رنگ‌آمیزی نمونه باید تثبیت شود. یکی از روش‌های معمول برای این کار، حرارت‌دهی است. لام حاوی نمونه باید چندین بار از روی شعله گاز عبور داده شود (برای چند ثانیه). این کار باعث می‌شود تا پروتئین‌های سطحی باکتری‌ها منعقد شده و به لام بچسبند. در برخی موارد می‌توان از مواد شیمیایی برای ثبیت نمونه استفاده کرد. این مواد مانند متیل الکل یا اتانول می‌توانند به عنوان ثبات‌دهنده شیمیایی عمل کنند.

• بازرسی و ارزیابی نمونه

پس از ثبیت نمونه، بهتر است که لام تحت میکروسکوپ نوری مورد کنترل قرار گیرد تا از وجود یک لایه نازک یکنواخت از باکتری‌ها اطمینان حاصل شود. اگر کشش به‌درستی آماده نشده باشد (مثلاً اگر باکتری‌ها خیلی غلیظ یا خیلی پراکنده باشند)، باید نمونه دوباره تهیه شود.

• آماده‌سازی محیط برای رنگ‌آمیزی

قبل از شروع رنگ‌آمیزی گِرَم، اطمینان حاصل کنید که تمام مواد شیمیایی و محلول‌ها (مثل کریستال ویوله، ید، الکل و سافرانین) آماده و در دسترس هستند. همچنین لام‌ها باید روی یک سطح صاف و پایدار قرار گیرند تا فرآیند رنگ‌آمیزی به درستی انجام شود.

توجه: برای مراحل رنگ‌آمیزی گِرَم، شرکت ایتالیایی BIO-OPTICA محصولات مختلفی دارد که می‌توانند به عنوان مواد اولیه برای این فرآیند استفاده شوند. به عنوان نمونه میتوان از محلول‌های رنگ‌آمیزی کریستال ویوله، محلولید با کیفیت بالا، اتیل الکل Ethyl Alcohol یا ایزوپروپیل الکل Isopropyl Alcohol تولیدی این شرکت و محلول‌های سافرانین با غلظت مناسب آن نام برد. این محصولات تخصصی تحت کنترل‌های دقیق برای این منظور توسط شرکت BIO-OPTICA به بازار عرضه می‌شوند. علاوه بر این شرکت ایتالیایی مواد شوینده و تمیزکننده لام، کیت‌های آماده رنگ‌آمیزی گِرَم و محلول‌های شستشوی مناسب با کیفیت بالا را عرضه می‌کند.

دستورالعمل رنگ آمیزی گِرَم

دستورالعمل رنگ‌آمیزی گِرَم (Gram Staining) یک روش پایه‌ای و مهم برای شناسایی و دسته‌بندی باکتری‌ها به دو گروه اصلی گِرَم مثبت و گِرَم منفی است. این روش بر اساس تفاوت در ساختار دیواره سلولی باکتری‌ها استوار است. در ادامه دستورالعمل جامع رنگ‌آمیزی گِرَم را توضیح می‌دهیم:

مواد مورد نیاز

1. کریستال ویوله (Crystal Violet)
2. ید (Iodine Solution)
3. الکل ایزوپروپیل (Isopropyl Alcohol) یا الکل اتیلیک (Ethyl Alcohol)
4. سافرانین (Safranin)
5. آب مقطر
6. لام شیشه‌ای تمیز
7. دستگاه حرارتی (برای ثبیت نمونه)

آماده سازی لام برای رنگ‌آمیزی گِرَم

مرحله اول آماده‌سازی لام شامل کشش و خشک کردن است. برای اینکار باید ابتدا یک قطره از نمونه میکروبی (می‌تواند از محیط کشت یا مستقیماً از نمونه‌برداری باشد) روی لام شیشه‌ای قرار دهید. سپس با استفاده از یک لام دیگر، نمونه را به‌طور یکنواخت در سطح لام پخش کنید. در انتها لازم است لام را به‌طور طبیعی یا با استفاده از حرارت ملایم خشک کنید تا نمونه روی لام ثابت شود.

تثبیت نمونه (Fixation)

لام را به‌آرامی از روی شعله گاز عبور دهید تا حرارت‌دهی انجام شود (۲-۳ بار عبور). این کار باعث می‌شود که باکتری‌ها به سطح لام چسبیده و از شسته شدن جلوگیری شود.

رنگ‌آمیزی با کریستال ویوله (Crystal Violet)

محلول کریستال ویوله را روی لام بریزید و به مدت ۱ دقیقه صبر کنید. این رنگ باعث می‌شود که تمام باکتری‌ها (چه گِرَم مثبت و چه گِرَم منفی) به رنگ بنفش درآیند. سپس لام را با آب مقطر شستشو دهید تا رنگ اضافی از روی لام شسته شود.

استفاده از ید (Iodine Solution)

محلولید را به مدت ۱ دقیقه روی لام بریزید. ید به‌عنوان عامل مورفولوژی (Mordant) عمل می‌کند و باعث می‌شود که رنگ کریستال ویوله به‌طور محکم‌تری به دیواره سلولی باکتری‌ها بچسبد. سپس لام را با آب مقطر شستشو دهید.

رنگ‌زدایی با الکل (Decolorization)

در این مرحله باید لام را با الکل ایزوپروپیل یا الکل اتیلیک شستشو دهید. این مرحله بسیار حساس است. به‌طور معمول، ۱۰-۱۵ ثانیه الکل را روی لام بریزید و سپس بلافاصله با آب مقطر بشویید. در این مرحله باکتری‌های گِرَم مثبت رنگ کریستال ویوله خود را حفظ می‌کنند (زیرا دیواره سلولی ضخیمی دارند) و باکتری‌های گِرَم منفی رنگ کریستال ویوله خود را از دست می‌دهند و بی‌رنگ می‌شوند (چرا که دیواره سلولی نازک‌تری دارند).

رنگ‌آمیزی نهایی با سافرانین (Safranin)

محلول سافرانین را روی لام بریزید و به مدت ۳۰ ثانیه تا ۱ دقیقه صبر کنید. سافرانین رنگ قرمز یا صورتی به باکتری‌های گِرَم منفی می‌دهد. سپس لام را زیر آب مقطر شسته و خشک کنید.

خشک کردن لام

لام را به‌آرامی با یک دستمال خشک یا کاغذ جاذب خشک کنید.

بررسی کیفیت لام زیر میکروسکوپ

لام برای مشاهده زیر میکروسکوپ آماده است. از یک میکروسکوپ نوری مشاهده کنید. باکتری‌ها باید به رنگ‌های مختلف دیده شوند.

• باکتری‌های گِرَم مثبت به رنگ بنفش (رنگ کریستال ویوله)
• باکتری‌های گِرَم منفی به رنگ قرمز یا صورتی (رنگ سافرانین)

توجه: باید اشاره کنیم که شرکت BIO-OPTICA محصولاتی مانند محلول‌های رنگ‌آمیزی، تثبیت‌کننده‌ها، محلول‌های شستشو و کیت‌های آماده را برای رنگ‌آمیزی گِرَم عرضه می‌کند. این محصولات می‌توانند به‌طور مؤثر در مراحل مختلف رنگ‌آمیزی، از آماده‌سازی لام تا شستشوی نمونه‌ها، مورد استفاده قرار گیرند و به آزمایشگاه‌ها کمک کنند تا نتیجه دقیق‌تری از رنگ‌آمیزی‌های میکروبی به‌دست آورند. شما می‌توانید ضمن ارتباط مراجعه به سایت شرکت BIO-OPTICA و سایت پاتولوژی شاپ در مورد نحوه تهیه این مواد و محصولات آزمایشگاهی اطلاعات لازم را کسب نمائید.

سخن پایانی

یکی از تکنیک‌های مؤثر در طراحی درمان بیماران مبتلا به بیماری‌های میکروبی، تست رنگ آمیزی گرم است. این تست به شناسایی نوع میکروب مهاجم بر مبنای غشای زیستی میکروب عمل می‌کند. برای راه اندازی این روش مؤثر و تهیه مواد مصرفی مورد نیاز می‌توانید با کارشناسان سایت شرکت BIO-OPTICA و سایت پاتولوژی شاپ مشاوره کنید.