در این مقاله سایت پاتولوژی شاپ، روشهای رایج و مدرن پردازش بافت را مقایسه میکنیم و نشان میدهیم هر روش چگونه بر «مورفولوژی»، «قابلیت برش»، «کیفیت رنگپذیری»، «آرتیفکتها»، و «آمادگی برای IHC و تستهای مولکولی» اثر میگذارد. هدف، انتخاب روش مناسب بر اساس نوع نمونه، فوریت و امکانات آزمایشگاه است؛ نه اینکه یک روش را برای همه موارد «بهترین» بدانیم.
پردازش بافت دقیقاً چه چیزی را کنترل میکند؟
پردازش استاندارد بافت (معمولاً برای بلاک پارافینی) سه کار اصلی انجام میدهد:
- آبگیری (Dehydration): خارج کردن آب از بافت با الکلهای با غلظت افزایشی.
- شفافسازی (Clearing): جایگزینی الکل با مادهای سازگار با پارافین (مثل زایلن یا جایگزینهای زایلن).
- نفوذدهی/اینفیلتریشن (Infiltration): پر کردن فضاهای بافت با پارافین مذاب تا بافت برای میکروتوم «سفت و قابل برش» شود.
اهمیت پردازش مناسب بافت
پردازش نامناسب بافت میتواند به چروک، پارگی، هستههای نامشخص، خلأهای بافتی، جداشدگی اپیتلیوم، شستگی لیپیدها یا از دست رفتن آنتیژنها منجر شود؛ یعنی همان خطاهایی که گاهی به تکرار برش، تکرار رنگ یا بدتر از همه تفسیر نادرست ختم میشوند.
کیفیت اسلاید یعنی کیفیت همان سه مرحله بهعلاوه «فیکساسیون» قبل از پردازش. اگر فیکساسیون ناکافی باشد، بهترین پروسس هم نمیتواند جزئیات هستهای را برگرداند. اگر آبگیری یا شفافسازی ناقص باشد، بافت نرم میماند، برشها موجدار میشوند و رنگپذیری ناهمگن میشود. اگر نفوذ پارافین کامل نباشد، سوراخها و گسستهای میکروسکوپی و شکنندگی برش ایجاد میشود.
دانلود چکلیست کنترل کیفیت پردازش بافت ⬇️
چه عواملی بیشترین اثر را بر کیفیت اسلاید دارند؟
صرفنظر از روش انتخابی، چند عامل مشترک بیشترین اثر را بر کیفیت خروجی دارند:
فیکساسیون (قبل از هر پردازش)
- فیکساسیون ناکافی: اتولیز، محوشدن جزئیات هستهای، رنگپذیری ضعیف.
- فیکساسیون بیش از حد یا نامنظم: کاهش کیفیت IHC و نیاز به بازیابی شدیدتر آنتیژن.
ضخامت قطعهبرداری (Grossing)
نمونههای ضخیم، دشمن نفوذ یکنواخت هستند. اگر قطعهها بیش از حد ضخیم باشند، پردازش سریع یا حتی روتین هم دچار نفوذ ناقص میشود.
انتخاب پروتکل متناسب با نوع بافت
بافت چرب، فیبروتیک، نکروتیک یا بسیار سلولار هرکدام پاسخ متفاوتی به آبگیری و شفافسازی میدهند.
کنترل کیفیت در خروجی (Feedback Loop)
اگر در میکروتومی یا رنگآمیزی مرتباً الگوهای مشخصی از آرتیفکت دیده میشود، باید به عقب برگردیم و پروتکل پردازش را اصلاح کنیم، نه فقط برش را تکرار کنیم.
مقایسه روشهای جاری در پردازش بافت
روش پردازش روتین پارافینی (Conventional Paraffin Processing)
برای اکثر نمونههای بیوپسی و جراحی روزمره وقتی محدودیت زمانی شدید نداریم مناسب است. و بهترین تعادل را بین کیفیت مورفولوژی و پایداری نمونه برای آرشیو طولانیمدت ایجاد میکند. این روش با H&E و اکثر رنگهای اختصاصی سازگار است. در صورت رعایت زمانبندی درست، آرتیفکتهای قابل کنترل دارد.
اما این روش با محدودیت هائی نیز همراه است که ممکن است بر کیفیت تأثیر بگذارند. به عنوان نمونه:
- زمانبر است و در نمونههای خیلی فوری مناسب نیست.
- بافتهای چرب (مثل پستان یا بافتهای پرلیپید) در شفافسازی ممکن است لیپیدهایشان شسته شود و حفرههای کاذب بسازد.
- برای IHC اگر فیکساسیون طولانی یا نامنظم باشد، ماسکه شدن آنتیژن افزایش پیدا میکند و نیاز به بازیابی آنتیژن شدیدتر میشود.
جمعبندی اثر بر اسلاید: اگر فیکساسیون و پروتکل استاندارد باشد، روتین پارافینی معمولاً بهترین کیفیت عمومی H&E را میدهد و قابل اتکاترین گزینه برای کارهای روتین است.
روش پردازش سریع (Rapid / Short Cycle Processing)
این روش برای بیوپسیهای کوچک، نمونههای کمحجم و شرایطی که گردش کار (TAT) باید کوتاه شود. مناسب است و از مزایای زیر برخوردار است:
- کاهش زمان پردازش و امکان گزارشدهی سریعتر.
- در بیوپسیهای کوچک اگر درست تنظیم شود، کیفیت قابل قبول ایجاد میکند.
البته روش پردازش سریع ممکن است با برخی محدودیتها و اثر بر کیفیت همراه باشد. مثلاً:
- در نمونههای بزرگتر، خطر آبگیری ناقص یا نفوذ ناقص پارافین بیشتر است.
- برشهای شکننده، لکهلکه شدن رنگ و بافت «خمیری» در میکروتومی به عنوان آرتیفکتهای رایج قابل ذکر هستند.
- ممکن است در برخی اهداف IHC، یکنواختی نتایج کاهش یابد چون بافت فرصت کافی برای تعادل شیمیایی با معرفها را نداشته است.
جمعبندی اثر بر اسلاید: پردازش سریع اگر فقط برای «نمونههای واقعاً کوچک» و با کنترل کیفیت دقیق استفاده شود، مفید است؛ اما برای نمونههای حجیم، ریسک افت کیفیت اسلاید و تکرار کار بالا میرود.
روش پردازش با میکروویو (Microwave-Assisted Processing)
این روش برای آزمایشگاههایی که دنبال کاهش زمان هستند ولی میخواهند کیفیت را نسبتاً بالا نگه دارند، بهخصوص برای نمونههای کوچک تا متوسط مناسب است.
تسریع نفوذ مواد با افزایش کنترلشده انرژی و دما و کاستن از زمان پروسس در حالی که جزئیات بافتی حفظ شود از مزایای این روش ذکر شدهاند.
میتوان موارد زیر را به عنوان محدودیتهای این روش ذکر کرد:
- حساس به تنظیمات است: دمای بالا یا زمان نامناسب باعث جمعشدگی بافت، هستههای «پخته»، یا ترکهای میکروسکوپی میشود.
- نیازمند استانداردسازی و مانیتورینگ دقیق است؛ وگرنه تغییرات بین سریها زیاد میشود.
جمعبندی اثر بر اسلاید: در صورت کالیبراسیون درست، میکروویو میتواند «سریع + باکیفیت» باشد؛ اما حاشیه خطای تنظیمات از روش روتین بیشتر است.
روش پردازش با خلأ و فشار (Vacuum/Pressure Infiltration)
پردازش با خلاء و فشار در مورد نمونههای متراکم یا فیبروتیک و آزمایشگاههایی که میخواهند نفوذ پارافین را بهبود دهند مناسب ذکر شده است. از موارد زیر به عنوان مزایای این روش میتوان نام برد:
- افزایش نفوذ مواد بهویژه در بافتهای سختتر.
- کاهش احتمال نفوذ ناقص و بهبود قابلیت برش.
محدودیتهای احتمالی
- اگر سیکلها بیش از حد تهاجمی باشند، ممکن است جمعشدگی افزایش یابد.
- نیازمند تنظیم درست بر اساس نوع بافت است.
جمعبندی اثر بر اسلاید: برای کاهش «نفوذ ناقص» و مشکلات میکروتومی در بافتهای دشوار، گزینه بسیار خوبی است و معمولاً کیفیت H&E را پایدارتر میکند.
روش پردازش رزینی (Resin Processing؛ مثل اپوکسی/متاکریلات)
مناسب برای نمونههای خاص مثل نیاز به برشهای بسیار نازک، بررسیهای دقیق ساختاری، برخی نمونههای استخوانی (پس از دکلسیفیکاسیون مناسب یا با رزینهای ویژه)
مزایا:
- برشهای بسیار نازک و دقیق و حفظ عالی جزئیات.
- مناسب برای مواردی که کیفیت ساختاری فوقالعاده لازم است.
اثر احتمالی بر کیفیت:
- زمانبر و پرهزینهتر
- نیازمند مهارت و مواد تخصصی.
- برخی رزینها با بعضی روشهای IHC یا استخراج اسید نوکلئیک سازگاری محدودتری دارند.
جمعبندی اثر بر اسلاید: برای کاربردهای ویژه، کیفیت ساختاری عالی میدهد؛ اما برای روتین پاتولوژی با حجم بالا معمولاً انتخاب اول نیست.
روش برش فریز (Frozen Section / Cryosection)
روش برش فریز برای تصمیمگیری داخل اتاق عمل، ارزیابی حاشیهها یا شرایطی که پاسخ فوری لازم است، مناسب است.
مزایای این روش عبارتند از:
- سریعترین روش برای ارائه پاسخ در لحظه.
- حفظ برخی مولکولها ممکن است بهتر باشد (در برخی کاربردهای خاص).
محدودیتهای احتمالی:
- معمولاً کیفیت مورفولوژی و هسته پایینتر از پارافین است.
- آرتیفکتهای رایج: کریستالهای یخ، پارگی، چروک و رنگپذیری ناهمگن.
- تفسیر میتواند سختتر شود و نیازمند تجربه بالاتر است.
جمعبندی اثر بر اسلاید: برای فوریت عالی است اما از نظر «کیفیت اسلاید تشخیصی روتین»، معمولاً پایینتر از پردازش پارافینی است.
راهنمای انتخاب روش مناسب (یک تصمیم عملی)
- روتین پارافینی: انتخاب اول برای کیفیت پایدار H&E و آرشیو.
- پردازش سریع: فقط برای بیوپسیهای کوچک و با کنترل دقیق.
- میکروویو: سریع با کیفیت خوب، به شرط استانداردسازی و کنترل دما/زمان.
- خلأ/فشار: برای بهبود نفوذ در بافتهای دشوار و کاهش مشکلات برش.
- رزینی: برای نیازهای خاص و جزئیات بسیار بالا.
- فریز: برای تصمیم فوری داخل عمل، با پذیرش کیفیت پایینتر از پارافین.
سخن پایانی
در این مقاله پاتولوژی شاپ دیدیم که روشهای پردازش بافت، یک طیف بین «کیفیت پایدار» و «سرعت پاسخ» میسازند. اگر هدف «بهبود کیفیت اسلاید» است، اصلاح فیکساسیون، ضخامت قطعهبرداری و استانداردسازی پروتکلها معمولاً بیشترین بازده را نسبت به تغییرهای شتابزده در روش پردازش دارد.
منابع:
https://www.leicabiosystems.com/en-it/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing
https://waxitinc.com/tissue-processing-guide
https://www.healthskybio.com/a-complete-guide-to-tissue-processing-in-histology.html