پلی‌ال لایزین Poly-L-lysine یک عامل اتصال غیراختصاصی برای سلول‌ها است و با افزایش تعامل الکترواستاتیکی بین یون‌های دارای بار منفی غشای سلولی و سطح کشت، در تقویت چسبندگی سلول به بسترهای جامد مفید است. این ماده یک کوپلیمر بسیار همه‌کاره برای اصلاح سطح است. پلی‌ال لایزین (Poly-L-lysine) در حقیقت به‌عنوان یک چسب بین بافت و لام عمل می‌کند. این محلول برای استفاده به‌عنوان یک محلول چسبنده برای ایمونوپروکسیداز و آماده‌سازی‌های معمول رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی در نظر گرفته شده است. برای تسریع و افزایش دقت در کار، لام‌های باردار دارای پوشش پلی‌ال لایزین در دو طرف لام بوده و برای تهیه لام از نمونه‌های بافتی در پاتولوژی کاربرد دارد و نگهداری طولانی‌مدت آنها را آسان می‌کند.

در فعالیت‌های پژوهشی و مطالعات تشخیصی، یکی از مشکلات ازبین‌رفتن پارافین و مقاطع منجمد از لام‌ها برای مدت طولانی در طی روش‌های معمول رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی بوده است. البته پلیمرهای Poly-l-lysine (PLL) علاوه بر استفاده به‌عنوان چسب در پاتولوژی، از مطلوب‌ترین حامل‌های ژن در بین ناقل‌های غیر ویروسی هستند.

مکانیسم عمل چسب پلی‌ال لیزین

PLL-g-PEG از یک ستون فقرات پلی (ال لیزین) با زنجیره‌های جانبی پلی (اتیلن گلیکول) پیوندی تشکیل شده است. PLL دارای بار مثبت است و بنابراین با سطوح دارای بار منفی تعامل دارد. اصل مکانیسم اتصال سلول پوشش‌دهنده پلی لیزین این است که مولکول‌های پلی کاتیونی پلی لیزین به‌شدت به سطوح شیشه‌ای جذب می‌شوند و محل‌های کاتیونی را ترک می‌کنند که با سایت‌های آنیونی روی سطوح سلول ترکیب می‌شوند. پلی لیزین یک پلیمر کاتیونی است که در آن پلی لیزین (به دلیل ماهیت بار مثبت آن) می‌تواند به‌راحتی با سطح دارای بار منفی در بسیاری از انواع سلول‌ها تعامل داشته باشد. پلی لیزین پس از جذب به سطح کشت، تعداد مکان‌های اتصال سلولی با بار مثبت را افزایش می‌دهد.

در صورت برخورداری از ساختار استاندارد، PLL-g-PEG را می‌توان برای مقاوم ساختن سطوح دارای بار منفی (مانند اکسید Ti-اکسید، سی – اکسید یا Nb-اکسید) در برابر جذب پروتئین استفاده کرد: ستون فقرات PLL روی سطح جذب می‌شود، درحالی‌که PEG برس تشکیل شده هر گونه پروتئین نزدیک به محلول آبی را دفع می‌کند. چیزی که این مولکول را جالب‌تر می‌کند این واقعیت است که گروه‌های انتهایی عملکردی را می‌توان به‌راحتی روی زنجیره‌های PEG سنتز کرد. این اصلاح نه‌تنها اجازه می‌دهد تا یک سطح مقاوم در برابر پروتئین تشکیل شود، بلکه درجه بالایی از عملکرد ویژه سطح که می‌تواند برای تثبیت مولکول‌های زیستی، به‌عنوان‌مثال، استفاده شود.

به‌عنوان‌مثال بر همکنش خاص بیوتین با آویدین باعث ایجاد یک گرادیان چگالی از هر مولکول بیوتینیله شده (بیوتینیله) می‌شود که می‌تواند از طریق پیوند بیوتین/آویدین به هم متصل شود.

ترکیب شیمیایی چسب پلی‌ال لایزین

Poly-L-lysine یک پلیمر اسیدآمینه با بار مثبت با تقریباً یک HBr در هر جایگاه لیزین است. هیدروبرومید به پلی‌ال لیزین اجازه می‌دهد تا به شکل کریستالی محلول در آب باشد. مقدار کمی از محصول ممکن است در ساختار بتا یافت شود زیرا HBr با پیوند هیدروژنی بین آمینو و گروه‌های کربوکسیل یا بخش‌های حاوی N یا O تداخل می‌کند. پلی‌ال لیزین با وزن مولکولی کمتر (30000-70000) در محلول حالت لزج کمتری دارد، اما نسخه‌های با وزن مولکولی بالاتر، محل اتصال بیشتری را در هر مولکول ایجاد می‌کنند.

کاربردهای چسب پلی الایزین

پلیمرهای Poly-L-lysine را می‌توان در موارد زیر مورداستفاده قرارداد

تقویت چسبندگی سلولی به بسترهای جامد
کونژوگاسیون به متوترکسات برای افزایش انتقال دارو
ریزپوشانی جزایر
فناوری ریزپوشانی سلولی
پوشش اسلاید شیشه‌ای ریزآرایه
آماده‌سازی کروموزومی
…

نمونه‌هایی از گزارش‌های منتشر شده کاربرد پلی‌ال لیزین

برای اتصال سلولی در آزمایش فعالیت انفجاری تنفسی
برای برچسب‌زدن ایمونوفلورسانس ساختارهای داخل سلولی
در پروتکل جداسازی سلول میوساتلایت
برای چسبندگی سلولی در کشت نورون E14 برای مطالعه مکانیسم احتمالی عمل circRNA_01477 در نورون‌ها

نگهداری محلول آماده چسب پلی‌ال لیزین

محلول پلی‌ال لیزین رقیق شده را می‌توان در یخچال (2 تا 8 درجه سانتیگراد) نگهداری کرد. محلول رقیق شده حداقل به مدت سه ماه پایدار است. اسلایدهای روکش‌دار در صورت محافظت از گردوغبار به مدت یک سال پایدار خواهند بود.

روش تهیه محلول

برای تهیه یک استاک 0.05 درصد، 5 میلی گرم پلی ال لیزین را باید در 10 میلی لیتر آب دیونیزه حل کرده و فیلتر استریل کردد. معمولاً باید مقدار کمی از 1 میلی لیتر تهیه و آنها را تا 1 سال در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

گیره‌های شیشه‌ای را با استفاده از فورسپس مخصوص روکش‌ها، در ظرف 6 چاهی قرارداد.
2 میلی لیتر پلی ال لیزین (0.1 درصد از سیگما، رقیق شده 1:10 در آب استریل) به هر چاهک اضافه شود.
3 بار با PBS استریل شستشو انجام شود.
به مدت 10 تا 15 دقیقه زیر نور ماوراء بنفش هود قرار گیرد تا استریل شود (پوشش را باید برداشت).
سلول‌های پلیت طبق معمول (از 2-2.5 میلی لیتر برای هر چاهک استفاده می‌شود).

پروتکل آماده‌سازی محصولات مِرک

سایت تخصصی مرک پروتکل[1] زیر را برای کاربرد چسب پلی‌ال لایزین (پروتکل پیوست سلولی Poly-L-Lysine)

تنظیم کرده است:

شرایط بهینه باید برای هر خط سلول و کاربرد تعیین شود.
50 میلی لیتر آب گرید کشت بافت استریل را به 5 میلی گرم پلی لیزین اضافه کنید.
سطح کشت را با 1.0 میلی لیتر / 25 سانتی متر مربع (فقط) به صورت آسپتیک بپوشانید.
برای اطمینان از پوشش یکنواخت سطح کشت، به‌آرامی تکان دهید.
پس از 5 دقیقه محلول را با آسپیراسیون بردارید و سطح را با آب درجه کشت بافت استریل کاملاً بشویید.
اجازه دهید حداقل 2 ساعت قبل از وارد کردن سلول و محیط خشک شود.
*توجه: مرحله 1 برای محلول‌های پلی لیزین (P4707 و P4832) ضروری نیست.
سلول‌ها را با استفاده از پلی لیزین به یک سطح بچسبانید

روش روکش کردن اسلایدها با چسب پلی‌ال لیزین

یک شیشه رنگ‌آمیزی پوششی (شیشه کوپلین کوچک) را با 9 میلی‌لیتر محلول پلی‌ال لیزین (0.1 درصد وزنی بر حجم در H2O، Sigma P8920) پر کنید. همچنین، 20 میلی‌لیتر پلی‌ال لیزین را در یک لوله سانتریفیوژ 50 میلی‌لیتری قرار دهید. پلی لیزین را می‌توان حداقل برای چند هفته در شیشه لکه‌دار یا لوله سانتریفیوژ نگهداری کرد.
ورقه روکش را به مدت 5 دقیقه در پلی لیزین خیس کنید (حداکثر 7 ورقه در شیشه رنگ‌آمیزی: 4 ورقه مستقیم و 3 عدد روی مورب؛ یکی یکی در لوله سانتریفیوژ بهتر است).
روی لبه، روی کاغذ جاذب بگذارید تا خشک شود. در عرض چند ساعت استفاده کنید.

ملاحظات ایمنی در استفاده از چسب پلی‌ال لیزین

ε-Polylysine یک ماده بسیار بی‌خطر است که توسط تخمیر میکروبی تولید می‌شود. PLL دارای مشکلات انتقال و ایمنی پایینی است.

در برخی موارد ممکن است باعث تحریک دستگاه تنفسی شود.
اگر از طریق پوست جذب شود احتمال دارد مضر باشد و باعث تحریک پوست شود.
در صورت تماس مستقیم با چشم‌ها ممکن است باعث تحریک چشم شود.
در صورت بلعیده‌شدن ممکن است برای سلامتی مضر باشد

مقایسه دو انانتیومر پلی‌ال لیزین

شماتیک مولکول‌های انانتیومر

L-lysine یک هوموپلی پپتید با دو شکل انانتیومر L و D لیزین است[2]. از طریق سه گروه فعال خود (اسید کربوکسیلیک و آمین‌های α و ε)، ال لیزین ظرفیت تولید ساختارهای پلیمری شاخه‌دار مختلف، از جمله دندریمرها، پلی لیزین شاخه‌دار و پلی لیزین هایپر شاخه (PLL) را دارد. Poly-L-lysine پلیمری است که از بقایای اسیدآمینه با بار مثبت تشکیل شده است و هر باقی‌مانده لیزین معمولاً حاوی یک HBr است. در مورد خصوصیات پلی‌ال لیزین در مقاله توضیح داده شد. انانتیومر دیگر دی لایزین است. Poly-D-Lysine هم مانند پلی‌ال لیزین باعث افزایش چسبندگی سلول‌های کشت شده بر روی ورقه‌های پوششی می‌شود. خاصیت پلی کاتیونی این مولکول امکان بر همکنش با مکان‌های آنیونی روی سلول‌ها را فراهم می‌کند و باعث اتصال مؤثر به سطح درحال‌رشد می‌شود.

Poly-D-Lysine یک ماتریکس خارج سلولی سنتز شده شیمیایی است که برای تسهیل چسبندگی سلول به سطوح پلاستیکی و شیشه‌ای تحت کشت بافت استفاده می‌شود. Poly-D- Lysine حاوی پلیمرهایی در محدوده وزن مولکولی 50000-150000 دالتون است که این محصول را برای کاربردهای کشت عصبی ایده آل می‌کند.

محلول Poly-D-Lysine باعث افزایش چسبندگی بافت‌ها/بخش‌ها به رک کشت می‌شود. سطح پوشش برای گونه‌ها و انواع سلول‌ها متفاوت است. به‌طورکلی غلظت پوشش نهایی از 3-10μg/cm از سطح، پوشش‌های کافی را برای اکثر انواع سلول، به طور معمول، تأمین می‌کند.

منابع

[1] پروتکل برای شماره های محصول P4707*، P4832*، P7280، P6407، P7405، P9155، P6282 و P5899 اعمال می شود.

[2] انانتیومر یا ایزومر نوری یا همپار نوری (به انگلیسی: Enantiomer ) (املاهای دیگر: انانتیمر یا انانتیُمر) در شیمی، یکی از ایزومرهای فضایی است که به‌طور کامل انطباق‌پذیر بر روی تصاویر آینه دیگر می‌باشد، با آن که جهات دست راست و چپ آن یکسان هستند اما با هم متضاد می‌باشند. به هنگام قرارگیری در یک محیط متقارن، ملکولهای «انانتیومر» پاد همسان، مشابه با ویژگیهای شیمیایی و فیزیکی هستند به غیر از آن که در اندازه‌هایی برابر اما در جهات مخالف صفحه – نور پلاریزه را می‌چرخانند. مخلوط اجزایی یکسان از یک ایزومر نوری فعال و ایزومر «انانتیومر» پادهمسان آن اصطلاحاً راسمیک یا خوشه سان نامیده می‌شود که دارای چرخش خالص صفر در صفحه نور پلاریزه می‌باشد.

برای تهیه انواع تجهیزات پاتولوژی، می‎توانید از طریق وبسایت ثبت سفارش کنید؛ در صورتی نیاز به مشاوره دارید با شماره های زیر تماس بگیرید: 09121916608 یا 09129153154 تماس بگیرید.

ناموجود