سینی رنگ آمیزی آزمایشگاه

سینی رنگ آمیزی آزمایشگاه چیست؟

سینی های رنگ آمیزی به طور خاص برای انکوباسیون و ذخیره سازی لام های ایمونوهیستوشیمی طراحی شده اند. این سینی ها نه تنها برای رنگ آمیزی معمولی، بلکه برای آزمایشگاه های هماتولوژی، سیتولوژی و میکروبیولوژی نیز مناسب است. سینی ها معمولا به گونه ای طراحی و با استفاده از مواد مناسبی ساخته می شوند که در برابر طیف گسترده ای از مواد شیمیایی مقاوم باشند. در این سینی ها ریل های پلاستیکی پوشیده شده با یک نوار پلیمری برای اینکه اسلایدها را (حتی زمانی که سینی در زاویه نگه داشته می شود) کاملاً در جای خود نگه دارد، طراحی می شود.

برخی از این سینی‌ها که از اکریلیک ریختگی شدۀ سیاه ساخته شده‌اند، مانع از رسیدن نور به لام‌های رنگ‌شده می‌شوند و نیازی به پیچیدن سینی‌های رنگ‌آمیزی با فویل آلومینیومی را از بین می‌برند. در برخی از نمونه‌ها، برای تأمین رطوبت، چاهک‌هایی بین ریل‌ها با ظرفیت تا یک میلی‌لیتر آب تعبیه می‌شوند. ریل‌ها نه‌تنها برای جلوگیری از تماس آب با اسلاید‌ها، بلکه برای آسان‌تر بازیابی آن‌ها طراحی می‌شوند. پایه همچنین محلول اضافی رنگ را که از لام ها می‌چکد، نگه می‌دارد. این سینی‌ها چهار پایۀ لاستیکی دارند که پایداری بیشتر پایه را تضمین می‌کند.

مرحله رنگ‌آمیزی بافت در پاتولوژی

رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی، فرایند رایج پزشکی در تشخیص پاتولوژیک و مطالعات پزشکی قانونی است. فرآیند رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی پنج مرحلۀ کلیدی را طی می‌کند که شامل تثبیت، پردازش، جاسازی، برش و رنگ‌آمیزی می‌شود.

در مراحل اولیۀ توسعۀ بافت‌شناسی، بافت شناسان اولیه از مواد شیمیایی در دسترس برای آماده سازی بافت‌ها به‌منظور مطالعات میکرسکوپیک استفاده می‌کردند. این مواد شیمیایی آزمایشگاهی مثل دی کرومات پتاسیم، الکل و کلرید جیوه برای مطالعۀ بافت‌های سلولی سخت مناسب بودند. این تثبیت‌کننده ها و رنگ‌آمیزی ها مبتکرانه بودند و پس از مدتی مواد رنگی آمیزی با رنگ های متنوع برای اهداف متفاوت تولید شدند که امروزه نیز در تکنیک‌های رنگ‌آمیزی آزمایشگاهی قابل‌استفاده هستند.

برخی روش‌های رنگ‌آمیزی به‌دلیل سمی بودن مواد شیمیایی موردنیاز از نظر پزشکی ممنوع‌شده است. علاوه بر این، افزایش حجم فعالیت‌ها نیاز به تکنیک‌های رنگ‌آمیزی پیشرفته تر را ایجاد نموده است. مطالعات موردی نشان می‌دهد که در بافت‌شناسی مدرن، ترکیبی از تکنیک‌های مختلف رنگ‌آمیزی برای افزایش اثربخشی فرآیند رنگ‌آمیزی مورداستفاده قرار می‌گیرد. در بافت‌شناسی مدرن، به‌عنوان راهی برای بهبود رنگ‌های بافت‌شناسی، چندین رنگ اصلاح‌شده با سایر رنگ‌ها برای دستیابی به ارتقای اثربخشی ترکیب شده است.

چگونه یک بافت در آزمایشگاه رنگ‌آمیزی می‌شود؟

در آزمایشگاه هیستوپاتولوژی، اصطلاح «رنگ‌آمیزی روتین» به رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) اشاره دارد که «به‌طورمعمول» در تمام نمونه‌های بافتی برای آشکارسازی ساختارها و شرایط بافتی زیرین استفاده می‌شود. اصطلاح «رنگ‌های ویژه» مدت‌هاست که برای اشاره به تعداد زیادی از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی جایگزین استفاده می‌شود که زمانی استفاده می‌شوند که H&E تمام اطلاعات موردنیاز آسیب‌شناس یا محقق را ارائه نمی‌دهد.

آماده سازی بافت برای رنگ آمیزی:

قبل از رنگ‌آمیزی و مشاهدۀ بافت، باید آن را به روش زیر آماده کرد:

اول باید عملیات تثبیت بافت (به‌منظور جلوگیری از پوسیدگی) انجام گیرد. دو تکنیک اصلی منجمدسازی و خوابانیده شده در پارافین برای این کار استفاده می شود.. تثبیت بافت همچنین موجب سخت شدن و حمایت از بافت می‌شود تا بتوان آن را به بخش‌های بسیار نازک موردنیاز (معمولاً 2-7 میکرومتر) برش داد.

پس از تثبیت بلوک بافت، بخشی بسیار نازک، تا حد تنها یک سلول ضخیم، باید بریده شود. این برش باید روی لام میکروسکوپ قرار گیرد و آماده شود.

روش منجمدسازی زمانی استفاده می‌شود که پاسخ‌ها به‌سرعت لازم باشد، معمولاً در طی جراحی که جراح باید مارجین برش را بداند. این روش سریع انجام می‌شود؛ اما معمولاً کیفیت روش تکنیک خواباندن در پارافین را ایجاد نمی‌کنند. فرآیند آماده‌سازی بخش منجمد به شرح زیر است:

• بافت به‌سرعت منجمد می‌شود تا حفظ و سفت شود.
• بافت منجمد در کرایوستات (یک میکروتم برش دهنده در یک محفظۀ انجماد) برش داده می‌شود و برای رنگ‌آمیزی روی لام میکروسکوپ قرار می گیرد.
• این بخش بلافاصله قبل از شروع پوسیدگی ثابت می شود و سپس رنگ می شود.

در روش خوابانیدن بافت در پارافین، نمونه ابتدا با یک فیکساتور ثابت می‌شود و سپس ساختار بافت با نفوذ موم پارافین به نمونه پشتیبانی می‌شود. این فرآیند نسبت به ایجاد مقاطع منجمد زمان‌برتر است، اما در بیشتر موارد رنگ‌آمیزی با کیفیت بهتری ارائه می‌کند و نمونه‌های حاصل (که به آن‌ها بلوک گفته می‌شود) تقریباً به‌طور نامحدود ذخیره می‌شوند. فرآیند بخش پارافین به شرح زیر است:

• بافت برای حفظ شدن تثبیت می‌شود (معمولاً با استفاده از محلول با پایه فرمالدئید).
• Grossing : ناحیه خاصی از بافت که باید برش داده شود، جداسازی می شود.
• فرآوری بافت انجام می‌شود. فرآوری بافت با استفاده از زنجیره‌ای از معرف‌ها، محیط آبی (مبتنی بر آب) را با محیط آب‌گریز جایگزین می‌کند که به عناصر بافتی امکان نفوذ موم پارافین را می دهد.
• نشانیدن: نشانیدن بافت در پارفین اجازۀ جهت‌گیری را به نمونه می‌دهد و نمونه را در بلوک موم برای برش و ذخیرۀ اسلایس ها حفظ می کند.
• برش توسط میکروتم انجام می‌شود که اسلایس های بسیار باریک را برش می‌دهد که روی حمام آب شناور می‌شوند و سپس برداشته می‌شوند و روی لام های میکروسکوپ قرار می گیرند.
• سپس اسلایدها در فر یا روی صفحه داغ خشک می شوند تا رطوبت از بین برود و به چسبیدن بافت به لام کمک شود.
• اکنون بافت روی لام برای رنگ‌آمیزی آماده است.
• اولین مرحله رنگ‌آمیزی، موم‌زدایی است که از یک حلال برای حذف موم از لام قبل از رنگ‌آمیزی استفاده می‌کند.
• موم‌زدایی همیشه به‌عنوان بخشی از فرایند رنگ‌آمیزی انجام می‌شود. هنگامی که رنگ‌آمیزی کامل شد، بخش با شیشه‌ای پوشانده می‌شود که آماده‌سازی را دائمی می کند.

علت رنگ‌آمیزی نمونه پاتولوژی:

رنگ‌آمیزی معمول H&E و رنگ‌های خاص نقش مهمی در تشخیص یا تحقیقات مبتنی بر بافت دارند. زیرا نمای بسیار دقیقی از بافت را در اختیار آسیب‌شناس یا محقق قرار می‌دهند. این امر با رنگ آمیزی واضح ساختارهای سلولی از جمله سیتوپلاسم، هسته، اندامک ها و اجزای خارج سلولی به‌دست می آید.

با رنگ‌آمیزی شفاف برش‌های بافت، این رنگ‌ها به آسیب‌شناسان و محققان آموزش‌دیده این امکان را می‌دهد تا مورفولوژی (ساختار) بافت را زیر میکروسکوپ مشاهده کنند یا وجود یا شیوع انواع سلول‌ها، ساختارها یا حتی میکروارگانیسم‌هایی مانند باکتری‌ها را جست‌وجو کنند.

کاربرد سینی رنگ‌آمیزی:

سینی‌های رنگ‌آمیزی جزو لوازم تسهیل گر و افزایندۀ دقت‌های مرتبط با قابلیت های تکنیکی کاربر هستند. این سینی‌ها برای نگهداری لام های رنگ‌آمیزی شده، امکان دسترسی سریع و امن و ساده به اسلایدها، حفظ موقعیت فضایی اسلاید‌ها حین عملیات رنگ‌آمیزی، آبکشی کردن و خشک‌کردن اسلاید‌ها، حفظ اسلایدهای رنگ‌آمیزی شده در برابر نور و دیگر بخش‌های روش‌های رنگ‌آمیزی در آزمایشگاه‌های هیستولوژی و پاتولوژی استفاده می شوند.

انواع رنگ‌آمیزی بافت

رنگ‌آمیزی روتین و عمومی (هماتوکسیلین و ائوزین)

مروری بر رنگ‌های هماتوکسلین و ائوزین:

برای مشاهدۀ جزئیات ساختار سلولی و بافتی در تشخیص‌های معمولی نسبت به سایر روش‌های رنگ‌آمیزی، استفاده از هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) توسط پاتولوژیست‌ها ترجیح داده می‌شود. تغییر شدت رنگ اغلب ناشی از تجربۀ یادگیری پاتولوژیست و ترجیحات شخصی است. ازآنجایی‌که این رنگ طیف وسیعی از ویژگی‌های ماتریکس سیتوپلاسم، هسته‌ای و خارج سلولی را نشان می‌دهد، تقریباً همۀ متون آموزشی از تصاویر H&E استفاده می‌کنند. امروزه استفاده از این رنگ‌آمیزی ساده و ضروری که بیش از یک قرن بدون تغییر باقی ‌مانده است، همچنان ادامه دارد.

رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) به‌طورمعمول در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی به این دلیل استفاده می‌شود که نمای بسیار دقیقی از بافت را در اختیار آسیب‌شناس یا محقق قرار می‌دهد. این امر با رنگ آمیزی واضح ساختارهای سلولی از جمله سیتوپلاسم، هسته، اندامک ها و اجزای خارج سلولی به‌دست می‌آید. این اطلاعات اغلب برای تشخیص بیماری (بر اساس سازمان‌دهی یا عدم سازمان‌دهی) سلول‌ها کافی است و همچنین هرگونه ناهنجاری یا شاخص خاصی را در سلول‌های واقعی نشان می‌دهد (مانند تغییرات هسته‌ای که معمولاً در سرطان مشاهده می شود). حتی زمانی که از روش‌های رنگ‌آمیزی پیشرفته استفاده می‌شود، رنگ H&E همچنان بخش مهمی از تصویر تشخیصی را تشکیل می‌دهد زیرا مورفولوژی بافت زیرین را نشان می‌دهد که به آسیب‌شناس یا محقق اجازه می‌دهد تا به‌درستی رنگ‌آمیزی پیشرفته را تفسیر کند.

در یک آزمایشگاه بافت‌شناسی کلینیکی، تمامی نمونه‌ها ابتدا با H&E رنگ‌آمیزی می‌شوند و رنگ‌آمیزی های خاص یا پیشرفته تنها در صورتی سفارش داده می‌شوند که اطلاعات بیشتری برای ارائۀ تحلیل دقیق تر، مثلاً برای تمایز بین دو نوع سرطان از نظر مورفولوژیک مشابه، موردنیاز باشد. به‌دلیل حجم رنگ‌آمیزی H&E لازم، بیشتر آزمایشگاه‌های بالینی از سیستم‌های کاملاً خودکار استفاده می‌کنند و رنگ‌آمیزی دستی اکنون نادر است.

ساختار شیمیایی هماتوکسیلین

احتمالاً هماتوکسیلین رایج‌ترین ضدرنگ هسته‌ای(counterstain) است که هنگام استفاده از سیستم تشخیص آنزیم/کروموژن استفاده می‌شود. فرمول‌های مختلفی وجود دارد که بر اساس نوع ماده مورد استفاده و پیش‌رونده یا پس‌رونده بودن طبقه‌بندی می‌شوند. همه آن‌ها درنهایت، بسته به نوع هماتوکسیلین استفاده‌شده، رنگ آبی دل پذیری با رنگ و شدت متفاوت به هستۀ سلول می دهند.

ساختار شیمیایی هماتوکسیلین

هماتوکسیلین مانند یک رنگ پایه با رنگ آبی مایل به ارغوانی واکنش نشان می‌دهد. ساختار اسیدی یا بازوفیل از جمله هسته سلولی (که حاوی DNA و نوکلئوپروتئین است) و اندامک های حاوی RNA مانند ریبوزوم ها و شبکۀ آندوپلاسمی خشن را رنگ می کند.

ائوزین یک رنگ اسیدی است که معمولاً مایل به قرمز یا صورتی است. ساختارهای بازی یا اسیدوفیل را که شامل سیتوپلاسم، دیوارۀ سلولی و الیاف خارج سلولی می‌شود، رنگ می کند.

ائوزین از گروه رنگ‌های قرمز فلورسنت است که یک مشتق مصنوعی از فلورسین است و دو ترکیب نزدیک به هم، ائوزین Y و ائوزین B دارد. ائوزین Y که یک مشتق تترابروم فلورسئین است و رنگ آن کمی مایل به زرد است (به همین دلیل به نام زرد ائوزین نیز شناخته می‌شود) به‌مراتب بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد. ائوزین Y را می‌توان به ائوزین Y محلول در آب و محلول در اتانول تقسیم کرد. در برخی تجربه‌ها، ائوزین Y محلول در اتانول سریع‌تر رنگ می‌شود و رنگ قرمز درخشان‌تری نسبت به نوع محلول در آب می‌دهد. ائوزین B مشتقی از دیبروم دینیترو از فلورسین است و دارای قالب آبی کم‌رنگ است. ائوزین B به همان اندازۀ ائوزین Y عمل می‌کند و گاهی اوقات می‌تواند رنگ قرمز درخشان تری بدهد. این دو رنگ قابل تعویض هستند. استفاده از یکی یا دیگری احتمالاً فقط به‌دلیل ترجیح شخصی یا روش آزمایشگاهی است. از ائوزین می‌توان برای رنگ‌آمیزی سیتوپلاسم، گلبول‌های قرمز، کلاژن و فیبرهای عضلانی برای بررسی بافت‌شناسی استفاده کرد.

ساختار شیمیایی ائوزین Y

ائوزین اغلب به‌عنوان ضدرنگ هماتوکسیلین در رنگ‌آمیزی H&E استفاده می‌شود. در H&E، ائوزین Y معمولاً در غلظت‌های 0.5-1٪ (0.5-1 گرم ائوزین Y در 100 میلی‌لیتر آب‌مقطر یا 75٪ اتانول) استفاده می شود.

نمایی از بافت‌های شبکیه چشم

نمایی از بافت‌های شبکیه چشم که با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین رنگ‌آمیزی شده‌اند. هسته‌های سلول با رنگ آبی و بنفش و بیرون سلول با رنگ صورتی رنگ‌آمیزی شده است.

مروری بر رنگ‌های خاص مورد استفاده در پاتولوژی:

اصطلاح “رنگ های ویژه(special stains)” به‌طور سنتی به هر رنگی غیر از H&E اطلاق می‌شود. این روش طیف گسترده‌ای از روش‌ها را پوشش می‌دهد که ممکن است برای تجسم ساختارهای بافتی خاص، عناصر یا حتی میکروارگانیسم هایی که با رنگ آمیزی H&E قابل شناسایی نیستند، استفاده شود.

برخی روش‌های رنگ‌آمیزی، از روش ایمونوهیستوشیمی یا هیبریداسیون درجا برای شناسایی پروتئین‌های خاص یا توالی‌های DNA/RNA استفاده می‌کنند. این روش‌ها گاهی اوقات در طبقه “رنگ های ویژه” نیز گنجانده می‌شوند. بااین‌حال، آن‌ها از نظر روش و هدف کاملاً متفاوت هستند و اکنون معمولاً در گروه سومی که به‌عنوان “رنگ‌های پیشرفته” شناخته شده اند، طبقه‌بندی می شوند.

درحالی‌که به معنای واقعی کلمه صدها رنگ خاص با اهداف ویژه وجود دارد، تنها تعداد اندکی از آن‌ها در بافت‌شناسی کلینیکی استفاده می‌شود. تنوع رنگ‌ها همچنین به این معنی است که رنگ‌آمیزی خاص به‌اندازۀ رنگ‌آمیزی H&E به‌صورت اتوماتیک انجام نمی‌شود. درحالی‌که بسیاری از آزمایشگاه‌های مجهزتر از تجهیزات اتوماتیک برای رنگ‌های رایج‌تر استفاده می‌کنند، هنوز هم فضایی برای رنگ‌آمیزی دستی دارند. پیچیدگی برخی رنگ‌ها اجازۀ اتوماسیون نمی دهند.

تفاوت رنگ‌آمیزی عمومی و اختصاصی:

منظور از رنگ‌آمیزی معمول عمدتاً رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) است؛ درحالی‌که رنگ‌آمیزی ویژه برای اشاره به تکنیک‌های رنگ‌آمیزی جایگزین خارج از رنگ‌آمیزی معمول H&E برای ارائۀ اطلاعات خاص موردنیاز پژوهشگران یا آسیب‌شناسان استفاده می‌شود. به‌عنوان نمونه Masson’s Trichrome (skin) برای بافت پوست، Modified GMS Silver Stain برای بافت ریه، Periodic Acid Schiff (kidney) برای بافت کلیه‌ها، Perls’ Prussian Blue Iron (liver) برای بافت کبد Ziehl Neelsen (Acid Fast Bacillus, lung). برای بافت ریه، Alcian Blue (intestine)برای بررسی وجود acid mucopolysaccharides and acidic mucins و Gomori Trichrome (green) برای بررسی فیبرهای عضلانی به کار می روند.

نکاتی برای استفاده‌ی بهتر از رنگ‌های خاص

۱- کاربر باید رنگ‌ها و کاربرد آن‌ها را بشناسد.

کاربر باید بداند که با رنگ آمیزی خاصی می‌خواهد چه چیزی را نشان دهد. فقط “پیروی از روش” و ندانستن اینکه واقعاً هدف در انتهای روش، بررسی چه چیزی است، به نتایج ضعیف منجر می شود.

۲- لازم است از روش کنترل مثبت استفاده شود.

نباید فرض کرد که اگر ساختار یا ماده‌ای که هدف رنگ‌آمیزی مشاهدۀ آن است، در لام تحت بررسی قابل‌مشاهده نیست، وجود ندارد. همیشه باید اسلاید کنترل(شاهد) که حاوی ساختار یا موادی است که قرار است ارزیابی شوند، در دسترس باشد.

۳- زمان‌بندی دقیق باید رعایت گردد.

البته باید توجه کرد که هرچند زمان‌بندی همیشه تقریبی است، اما زمان بندی نادرست نتایج متناقض ایجاد می‌کند.

۴- میزان پایداری معرف باید کنترل شود.

هرچند فرض بر این است که همۀ معرف‌ها می‌توانند برای یک دورۀ نامحدود استفاده شوند، کاربر باید از عمر مفید معرف‌هایی که استفاده می کند، آگاه باشد. برخی از معرف‌ها یا محلول‌های رنگی به‌آرامی خراب می شوند؛ درحالی‌که برخی دیگر بسیار ناپایدارند و باید فوراً تازه ساخته شده و استفاده شوند. برخی دیگر باید مدتی باقی بمانند تا قبل از اینکه آنها را به کار گیرند، اکسیده (رسیده) شوند.

۵- باید از تکنیک بطور صحیح استفاده شود.

اگر کارکنان با استفاده از پروتکل یکسان، به نتایج متفاوتی دست پیدا کنند، ممکن است به این دلیل باشد که گام‌های متوالی پروتکل‌ها، درصدها و غلظت‌ها را بدرستی رعایت نمی کنند؛ لذا باید پروتکل دقیقاً رعایت و ایراد کار مشخص شود.

۶- میکروسکوپ باید به‌طور صحیح تنظیم گردد.

گاهی اوقات کارکنان به‌اشتباه یا به‌دلیل سهل‌انگاری، برای ارزیابی سطح رنگ‌آمیزی در همه روش‌ها به لام با چشم غیرمسلح نگاه می‌کنند؛ درحالی‌که لازم است از کنترل میکروسکوپی در مراحل حیاتی مانند مراحل تمایز استفاده شود. تنظیم میکروسکوپ بر ظاهر بخش‌های بدون پوشش (مرطوب) تأثیر گذاشته و ممکن است ظاهر رنگ‌آمیزی کاذب پس زمینه را ایجاد کند.

۷- از تجهیزات مناسب استفاده کنید.

سیستم رنگ‌آمیزی ویژه که برای رنگ‌های خاص شناخته می‌شود، باید برای کمک به آزمایشگاه‌های آسیب‌شناسی برای بهبود عملکرد و ارائۀ نتایج دقیق برای اطمینان تشخیصی طراحی شود.

مجموعه گسترده کیت‌های آماده برای رنگ‌های خاص و پروتکل‌های از پیش بهینه‌شده و قابل‌ویرایش، آزمایشگاه‌ها را قادر می‌سازد تا تعامل کاربر را در رنگ آمیزی های خاص پیچیده برای ارائه رنگ‌آمیزی ثابت و شفاف در هر بار به حداقل برسانند. ترکیبی از سیستم رنگ‌آمیزی ویژه، کیت های رنگ‌آمیزی آماده با کیفیت بالا، لوازم جانبی، کامپیوتر مجهز به نرم‌افزار مرتبط، چاپگر گزارش، چاپگر لیبل اسلاید و خدمات و پشتیبانی می توانند به آزمایشگاه در دستیابی به نتایج مطمئن کمک کنند.

8-معرف ها باید در جای مناسبی نگهداری شوند.

اگر همه معرف‌ها در قفسۀ بالای تخته رنگ‌آمیزی ذخیره شوند. گاهی اوقات ممکن است پارازیت هائی در بخش‌ها دیده شوند. لذا لازم است معرف‌ها به‌درستی ذخیره‌سازی شوند. برخی از آن‌ها به یخچال نیاز دارند؛ زیرا ممکن است محیط مناسبی برای رشد قارچ‌ها یا کپک‌ها باشند. برخی دیگر به نور حساس‌اند و به نگهداری در تاریکی نیاز دارند.

9- تغییرات باید ثبت شود.

گاهی اوقات نتایج ضعیف هستند؛ ولی به‌دلیل ثبت نشدن تغییرات پروتکل، تشخیص علت آن دشوار یا غیرممکن است. بنابراین لازم است هرگونه انحرافی از پروتکل استفاده‌شده مستند شود.

10 -مراحل شستشو باید استاندارد شود.

کارکنان آزمایشگاه مجاز نیستند از تکنیک‌های شستشوی متفاوتی استفاده کنند (برخی از هم زدن شدید و برخی دیگر از هم زدن بسیار ملایم‌تر). مراحل شستشو باید بادقت ویژه‌ای انجام گیرد. هر آزمایشگاهی آن‌ها را تا جایی‌که ممکن است، استاندارد کند؛ زیرا اغلب علت تغییر غیرمنتظره در نتایج هستند.