محلول پاتولوژی
چالشهای تشخیص بیماری: چرا به محلولهای پاتولوژی نیاز داریم؟
از اساسی ترین مراحل بهکارگیری پاتولوژی بهعنوان ابزار تشخیصی دقیق، تهیۀ نمونههای مناسب از تودههای زیستی که قرار است بررسی شوند، تهیۀ لام های مناسب از این تودههای مشکوک، رنگآمیزی لام ها و تهیۀ زمینهای با وضوح و کنتراست مناسب برای مطالعات میکروسکوپی و نهایتاً محلولهایی برای تثبیت و در صورت لزوم، نگهداری لام ها برای مطالعات تطبیقی یا افتراقی است.
-
محدودیتهای معاینات فیزیکی
رنگآمیزی و بررسیهای بافتشناسی اهمیت کلینیکی بسیار زیادی در تشخیص و درمان پزشکی تقریباً در هر حوزۀ پزشکی دارد. معاینه بافتشناسی استاندارد طلایی برای تشخیص بسیاری از بیماری های پاتولوژیک است که رنگآمیزی جزء ضروری آنهاست. تجزیهوتحلیل هیستوشیمیایی نمونۀ بافت به پاتولوژیست این امکان را میدهد که نهتنها تشخیص دهد، بلکه شدت بیماری و پیشآگهی را نیز ارزیابی کند.
پاتولوژیستها مثل هر انسان دیگری در حواس پنجگانۀ خود با محدودیتهایی مواجه اند که برای آنها تا حدی در تشخیص دقیق و افتراقی بیماری ها محدودیت ایجاد میکند. یکی از این محدودیتها، محدودیت در حد کمینۀ بینایی است. برای اینکه پاتولوژیست بتواند اطلاعاتی دقیقتر ازآنچه حالت عادی که در معاینات فیزیکی و تاریخ چه بیماری و شاخصهایی مثل حجم تودهها، تأثیرگذاری در وضعیت جسمی و کارکرد فیزیولوژیک ارگانها بهدست میآورد، گردآوری کند، لارم است از تکنولوژی بهعنوان عامل توانمندسازی حواس خود استفاده کند. این، یکی از محدودیتهایی است که موجب توسعۀ متدولوژی تهیۀ نمونههای پاتولوژیک شده است.
-
نیاز به بررسی دقیق سلولی برای تشخیص قطعی
تشخیص قطعی بیماری ها و امکان ارتقای دقت در تشخیص افتراقی، پاتولوژیست را بهسمت بررسیهای دقیق سلولهای تودهی تحت بررسی، جهت میدهد. ابعاد یک سلول انسانی، بهجز سلولهای عصبی بسیار کوچک است. اندازه و شکل سلولها بسیار متنوع میباشد. یکی از محدودیتهای دید انسان برای بررسی این سلولها، ابعاد سلول است. مسئله دیگر این است که ما نمیتوانیم پشت جسم را ببینیم؛ بهعبارتی جسم برای ما غیرشفاف است. این موارد بررسیهای میکروسکوپی را برای تشخیصهای دقیقتر و صحیحتر الزامی می کنند.
-
نقش محلولها در آمادهسازی و رنگآمیزی بافت
از مهمترین گامهای آماده سازی و رنگآمیزی سلولها، تثبیت بافت، ایجاد کنتراست با افزودن رنگهای متفاوت، شستشوی نمونهها و برداشتن برخی ترکیبات و مواد(چه آنهایی که بهطور طبیعی وجود دارند و چه آنهایی که در حین آماده سازی به بافت افزوده میشوند و در صورت باقی ماندن نقش پارازیت دارند) است.
ازطرف دیگر، استفاده از رنگهای مخصوص برای بافتها نهتنها به تشخیص تغییرات ساختاری بافتها کمک میکند، بلکه پزشک را دربارۀ تغییرات عملکرد بافتی که برای تشخیص بسیار مرتبط است و بسیاری از تغییرات دیگر را در فیزیولوژی سلولی تشخیص می دهد.
- قبل از اینکه رنگآمیزی نمونه انجام شود، نمونههای بافت باید در مراحل زیر آماده شوند: تثبیت، پردازش، درجانشانی، برش و ……. در آزمایشگاههای بافتشناسی مدرن، بیشتر این مراحل بهصورت خودکار انجام میشوند. محلولهای ثابت کنندۀ فرمالین بافر خنثی معمولاً در این مرحله استفاده قرار میگیرند. پارافین-فرمالین یک تثبیت کننده موثر دیگر است.
- مرحلۀ دیگر آمادهسازی، آبگیری است. اتانول معمولا 70درصد محلول مورد استفاده در این مرحله است و سپس برای برداشت اتانول از محلول زایلول استفاده می شود.
- درجا نشانی( Embedding) مرحلۀ بعدی است. موم پارافین یا یک رزین پلاستیکی در این مرحله مورد استفاده قرار می گیرد.
- در مرحلۀ آخر، سلول یا برش تهیهشده با رنگ های عمومی یا اختصاصی رنگآمیزی می شوند.
سفر یک نمونه تا لام پاتولوژی: داستانی با طعم دقت و ظرافت
مرحله اول: برداشت نمونه (بیوپسی)
فرض کنید که آقای B.N برای بررسی تودهای ناشناخته مراجعه میکند و پزشک دستور بیوپسی صادر میکند. روش انجام بیوپسی با توجه به بافت یا ارگانی که توده در آن قرار دارد، متفاوت است. بههرحال بیوپسی انجام میشود و نمونه برای بررسی به آزمایشگاه فرستاده میشود.
مرحله دوم: تثبیت بافت (انواع محلولهای تثبیتکننده و تأثیر آنها بر بافت):
تثبیت: فیکساسیون از مواد شیمیایی برای حفظ ساختار بافت به شکل طبیعی آن استفاده میکند و آن را از تخریب توسط پروتئینهای اتصال متقابل برگشتناپذیر محافظت میکند. اگرچه چندین فیکساتور تخصصی موجود است، فرمالین بافر خنثی انتخابی رایج برای این مرحله است. مرحله تثبیت برای بقیۀ مراحل رنگآمیزی بافتشناسی حیاتی است؛ زیرا با حفظ ترکیب شیمیایی بافت، نمونه سخت شده و مرحله برش را آسان میکند. پارافین-فرمالین یک تثبیتکننده موثر دیگر است. مزیت آن این است که فیکساتور انتخابی برای رنگآمیزی ایمنی است. بااینحال، در زمان تثبیت نیاز به آمادهسازی دارد.
مرحله سوم: پردازش و برش بافت(نقش محلولهای شفافکننده و نفوذپذیر در آمادهسازی بافت):
- آبگیری: اضافه کردن اتانول باعث جذب آب از نمونه میشود. اتانول آب را از نمونه خارج میکند و بافت را برای میکروسکوپ نوری نهایی سختتر میکند. پس از استفاده از اتانول و پس از اتمام آب گیری بافت، از زایلن برای برداشت اتانول استفاده می شود.
- درجا نشانی، فرایند قراردادن نمونه در موم پارافین یا یک رزین پلاستیکی برای بهبود فرایند استخراج ساختارهای سلولی است. اگر هدف انجام رنگآمیزی ایمنی باشد، این مرحله باید بااحتیاط انجام شود؛ زیرا موم پارافین از نفوذ آنتیبادی ها جلوگیری میکند و به نتیجۀ اشتباه منجر میشود.
- برش: برش شامل قراردادن نمونۀ روی میکروتم و برش آن به اسلایس ها است. ضخامت ترجیحی اسلایس ها معمولا 4-5 میکرومتر است تا بتوان آن را رنگآمیزی کرد و برای بررسی روی لام میکروسکوپ قرار داد.
مرحله چهارم: رنگآمیزی بافت (نقش محلولهای رنگآمیزی در آشکارسازی اجزای مختلف سلول):
هماتوکسیلین معمولاً رنگی است که در این مرحله به کار میرود، ائوزین ضدرنگ اسیدی است که پس از هماتوکسیلین انجام میشود و ساختارهای اساسی را هدف قرار میدهد.
دستورالعملهای عمومی دربارۀ محلول ها
- محلولهای موجود را بهطور منظم برای علائم خرابی بررسی کنید.
- تمام محلولها باید توسط شخصی که محلول را تهیهکرده است، تاریخ و پاراف داشته باشد.
- برای جلوگیری از آلودگی متقابل محلولها احتیاط کنید.
- برای تهیه محلول از آبمقطر یا دو بار تقطیر استفاده کنید.
- از مواد شیمیایی با درجۀ معرف استفاده کنید.
- از رنگهایی استفاده کنید که توسط کمیسیون رنگآمیزی بیولوژیکی تأیید شده اند.
- محلولها را همیشه در بطریهای درب دار نگه دارید.
- محلولهای یخچالی را باید داخل شیشه رنگ بریزید و محلول بطری شده را قبل از گرم شدن به دمای اتاق به یخچال برگردانید.
- برای جلوگیری از مخلوطشدن، تمام محلولهای رنگآمیزی را بلافاصله پس از استفاده به قفسهها برگردانید.
- همیشه از ظروف شیشهای تمیز استفاده کنید.
- مطمئن شوید که ترازو، PH متر و غیره در وضعیت مناسبی قرار دارند.
- تمام محلولهای رنگ و شیمیایی برای دمایی که باید در آن نگهداری شوند برچسبگذاری میشوند. این موارد عبارتاند از: در دمای اتاق، در دمای 3-6 درجه سانتیگراد و در دمای 14- تا 18- درجه سانتیگراد نگهداری شود. تمام رنگ ها و بیشتر مواد شیمیایی در دمای اتاق نگهداری می شوند.
پیوست: اطلاعات زیر پایداری محلولهای رنگآمیزی مورد استفاده در چندین روش رنگآمیزی رایج را نشان میدهد. ممکن است مدت زمان ماندگاری، با توجه به تغییر درجه حرارت در اتاق یا یخچالی که در آن نگهداری میشود و به دلیل کیفیت آب مقطر، مواد شیمیایی و رنگهایی که با آن تهیه شده اند، مشخص شده باشد.
Acid fuchsin, Frazer-Lendrum ——– 1 year
Acid fuchsin-picric acid (Verhoeff)——– 1 month
Alcian blue 1% (Mowry) ——– 6 months
Aldehyde fuchsin (Gomori) ——– 2 months
Aldehyde thionin (Shikata) ——– 1 month
Alizarin red S, 1% (Dahal) ——– 1 year
Aniline blue (Masson) ——– 2 months
Auramine O-rhodamine B (Truant) ——– 6 months
Basic fuchsin, 0.5% (Brown-Brenn)——– 3 months
Biebrich scarlet-acid fuchsin (Masson) ——– 2 months
Carbol-fuchsin (Ziehl-Neelsen) ——– 6 months
Congo red (Eastwood) ——– 6 months
Cresyl violet acetate ———————————————————–6 months
Crystal violet, Hucker-Conn (Gram) ——– 6 months
Crystal violet (Lieb) ——– 1 year
Diff-Quick fixative solution ——– 1 year
Diff-Quick solution I (eosin Y) ——– 1 year
Diff-Quick solution II (azure A-methylene blue) ——– 1 year
Eosin Y, alcoholic, stock ——– 1 year
Eosin Y, alcoholic, working ——– 6 months
Eriochrome black T (Truant) ——– 6 months
Erythrosin B, 1% (Kreyberg) ——– 2 months
Fast green, stock (counterstain) ——– 4 months
Fast green, working (counterstain) ——– 2 weeks
Gallocyanin (Einarson) ——– 1 week
Giemsa, stock (Wolbach) ——– 1 year
Giemsa, working (Wolbach) ——– 1 day
Gomoris trichrome, refrigerate ——– 6 months
Hematoxylin (Harris) ——– 6 months
Hematoxylin (Lillie-Mayer) ——– 1 year
Hematoxylin (Mallory PTAH) ——– 1 year
Hematoxylin, 5% alcoholic (Verhoeff) ——– 6 months
Hematoxylin (Weigert) ——– 1 week
Light green (Frazer-Lendrum) ——– 1 year
Luxol fast blue (myelin) ——– 1 year
Metanil yellow (Kreyberg) ——– 6 months
Methyl green (DNA) ——– 6 months
Methylene blue (Ziehl-Neelsen) ——– 6 months
Mucicarmine (Southgate), refrigerate——– 4 months
Mucicarmine (Southgate), working solution ———————————— 1 week
Nile blue —————————————————————————— 6 months
Nuclear fast red (counterstain) ——– 4 months
Oil red O, stock ——– 1 year +
Oil red O, working ——– 1 year
Orange G (Wilson-Ezrin) ——– 6 months
Orange G-picric acid (Frazer-Lendrum) ——– 1 year
Orcein (Shikata) ——– 6 months
Picric acid-acetone (Brown-Brenn) ——– 6 months
Picric acid, saturated aqueous ——– 1 year
Ponceau S —————————————————————————- 6 months
Pyronin Y (RNA) ——– 6 months
Schiffs solution (modified Lillie) ——– 1 year
Sudan black B, alcoholic ——– 1 year
Tartarazine, Southgate ——– 6 months
Thioflavin S (amyloid) ——– 1 week
Thioflavin T (Vassar-Culling)——– 3 months
Toluidine blue (mast cells) ——– 6 months
Verhoeffs elastic ——– 2 hours
Chemical and Other Solutions
Acetic acid, 1% (Vassar-Culling) ——– 6 months
Acetic acid, 3% (Mowry) ——– 6 months
Acetone-xylene (Brown-Brenn) ——– 6 months
Acid alcohol ——– 6 months
Ammonia-alcohol (Kreyburg)——– 3 months
Ammoniacal silver (Churukian), refrigerate ——– 1 month
Ammoniacal silver (Fontana-Masson), refrigerate ——– 1 month
Ammoniacal silver (Gomori), refrigerate ——– 1 week
Bouins ——– 6 months
Buffer solutions, refrigerate ——– months to years
Chromic acid-potassium dichromate-sulfuric acid ——– 6 months
Diastase of malt (PAS-D) ——– 1 day
Ethyl alcohol-acetone (Brown-Brenn)——– 6 months
Ferric chloride, 10% (Verhoeff) ——– 6 months
Formalin, 10% ——– 6 months
Formalin, 10% (Gomoris reticulum) ——– 6 months
Fouchets (Hall) ——– 1 day
Gold chloride, 0.2% (keep in the dark) ——– 6 months
Gold chloride, 1% (keep in the dark)——– 1 year
Gum mastic, 2.5% (Steiner), refrigerate——– 6 months
Grams iodine ——– 2 months
Hydrochloric acid, 2% (Pearl)——– 3 months
Hydrochloric acid, 1N (PAS) ——– 1 year
Hydrochloric acid, 5N (Feulgen) ——– 1 year
Lithium carbonate, saturated aqueous ——– 6 months
Lugols iodine ——– 6 months
Methenamine-silver nitrate, stock (GMS), refrigerate ——– 1 month
Mineral oil-xylene (Fite) ——– 1 year
Oxalic acid, 1% and 2%——————————————————- 6 months
Periodic acid, 0.5% (PAS) ——– 6 months
Periodic acid, 4% (MAS) ——– 6 months
Phosphoric acid, 1% ———————————————————- 6 months
Phosphotungstic acid, 5% ——– 6 months
Potassium ferrocyanide, 1% (Pearl) ——– 3 months
Potassium metabisulfite, 2% ——– 2 months
Potassium permanganate, 0.25% ——– 1 week
Potassium permanganate, 0.3%, acidified ——– 1 week
Potassium permanganate, 0.5% ——– 1 month
Sodium bisulfite, 1% (GMS) ——– 2 months
Sodium borate, 3% (GMS) ——– 6 months
Sodium thiosulfate, 2% ——– 6 months
Sodium thiosulfate, 5% ——– 6 months
Trichloroacetic acid, 25% (Hall) ——– 6 months
Triton X-100, 10% ——– 6 months
Uranyl nitrate-copper nitrate (Steiner) ——– 1 months
Zenkers with acetic acid ——– 1 year